32P-Postlabeling
Beim 32P-Postlabeling handelt es sich um eine Methode zum Nachweis von DNA-Addukten.
Einzelschritte
Enzymatische Hydrolyse
Im ersten Schritt erfolgt eine enzymatische Hydrolyse der DNA mittels Nuklease und Phosphodiesterase. Als Produkte entstehen 3'-Monophosphate. Enthielt die DNA DNA-Addukte, so entsteht ein Gemisch aus Addukten und adduktfreien Nukleotiden.
Adduktanreicherung
Die Anreicherung ist fakultativ, erhöht jedoch die Empfindlichkeit. In einem zweiten Schritt spaltet eine selektive P1-Nuklease das 3'-Phosphat von den normalen Nukleotiden ab. Die durch Addukte modifizierten Nukleotide sind abbauresistent, so dass es zu einer Anreicherung kommt.
Alternativ ist es auch möglich, mittels n-Butanol-Extraktion die Addukte mit hydrophober Struktur zu extrahieren und somit anzureichern.
Phosphorylierung
Zur Markierung der Nukleotide wird durch T4-Polynukleotid-Kinase ein radioaktiver Phosphatrest von [γ-32P]-ATP auf die Nukleotide im Ansatz übertragen. Es entstehen Desoxyribonukleosid-3'-[5'-32P]-bisphosphate.
Trennung und Nachweis
Mittels mehrdimensionaler Dünnschichtchromatographie und Szintillation bzw. mittels HPLC kann nun der Nachweis erfolgen. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Addukt auf 1010 N.
Literatur
- Ramesh C. Gupta: Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen: DNA Adducts. in: Cancer Research, 45, 5656-5662, November 1985, (PDF).
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