Bradford-Test
Der Bradford-Test ist eine photometrische Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen bis zu Konzentration im Bereich Mikrogramm pro Milliliter.[1] Er ist nach dem amerikanischen Biochemiker Marion M. Bradford benannt.
Prinzip
Der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) bildet in saurer Lösung mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe. Die ungebundene (kationische), rote Form des Farbstoffs hat im Absorptionsspektrum ein Maximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfonatform stabilisiert und das Absorptionsmaximum verschiebt sich auf 595 nm.[2] Da der Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes außerdem sehr viel höher als der des freien Farbstoffes ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagens photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung.
Das Maß der Farbreaktion ist vom Protein abhängig; deshalb wird zur Konzentrationsbestimmung eines bestimmten Proteins eine Kalibrierung notwendig. Steht diese nicht zur Verfügung oder soll die Konzentration eines Proteingemischs bestimmt werden, werden Standardproteine zur Kalibrierung genutzt (z.B. Chymotrypsin, Lysozym oder BSA). Dabei können je nach Zusammensetzung des Proteingemisches für gleiche Proteinmengen unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden. Somit ist die Bradfordbestimmung hier ungenau. Ihre Vorteile sind ihre hohe Sensitivität und die einfache und schnelle Durchführung.
Bestimmungsgrenze
Die Bestimmungsgrenze des Mikrotests beträgt 1-20 µg/ml, des Makrotests 20-200 µg/ml Protein.
Störende Substanzen
Salze in physiologischen Konzentrationen und Saccharose haben keinen Einfluss auf das Ergebnis. Hingegen stören Detergenzien wie z.B. SDS, Denaturierungsmittel wie Harnstoff, Guanidiniumchlorid oder Thioharnstoff, und Reduktionsmittel wie DTT (Dithiothreitol). Diese Störanfälligkeit ist ein weiterer Nachteil des Bradford-Tests, da diese Substanzen in der Proteinchemie routinemäßig eingesetzt werden. Können sie nicht aus den Proteinproben eliminiert werden, ist es möglich, die Kalibrierung des Tests und die Proteinbestimmungen - innerhalb gewisser Grenzen - in Gegenwart einer festen Konzentration der störenden Substanz durchzuführen. Dabei verliert man allerdings an Sensitivität.
Vorteile
- Schnell und preiswert
- Sehr sensitiv
- Farbstoff-Protein-Komplex ist für knapp eine Stunde stabil
Nachteile
- Kalibrierung nötig
- Störanfällig gegenüber proteinchemischen Reagenzien
- Nicht-lineare Standardkurve über einen großen Bereich
- Die Empfindlichkeit für verschiedene Proteine kann weit streuen, womit die Wahl des Standards wichtig wird. Die Methode ist für eine genaue Quantifizierung nur eingeschränkt brauchbar.
Literatur
- ↑ Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. In: Anal. Biochem. Bd. 72, S. 248-254. PMID 942051 doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3 PDF
- ↑ Compton, S. J., Jones, C. G.: Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. In: Anal. Biochem. Bd. 151 (1985), S. 369–374. PMID 4096375 doi:10.1016/0003-2697(85)90190-3