Plasmidpräparation
Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Plasmidpräparation ist eine Variante der DNA-Extraktion.
Anwendung
Die Verwendung von Plasmiden hat sich als grundlegende Methodik in der Molekularbiologie etabliert und stellt ein wertvolles Hilfsmittel dar, genetisches Material zu vervielfältigen oder bestimmte Gene in andere Organismen zu übertragen. Zur Isolierung kleiner Mengen an Plasmiden bis 25 µg steht die Minipräp zur Verfügung, für größere Mengen bis 1 mg eignet sich die Maxipräp. Beide werden verwendet, um Plasmide aus transformierten Bakterien, zumeist Escherichia coli, präparativ zu erhalten. Größere Mengen (1 mg - mehrere Gramm) sind nur schwer und meist in schlechter Qualität im Labor herzustellen. Für solche Mengen gibt es Firmen die sich auf die Herstellung/Vermehrung von Plasmiden spezialisiert haben.
Man unterscheidet:
- Minipräparation (kurz Minipräp, engl. miniprep) für geringe Plasmidmengen. - kann im Labor selbst gemacht werden.
- Maxipräparation (kurz Maxipräp, engl. maxiprep) für größere Plasmidmengen (ab etwa > 50 µg) - kann im Labor selbst gemacht werden.
- Auftragspräparation für sehr große Plasmidmengen zum Beispiel für die Gentherapie (ab 1 mg bis hin zu mehreren Gramm) - für diese Mengen gibt es spezielle Hersteller.
Verfahren
Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Plasmidpräparation, eine häufig verwendete ist die "alkalische Lyse". Die Bakterien mit dem Plasmid werden mit ca. 5000 x g abzentrifugiert und das Pellet anschließend in einem Puffer resuspendiert. Zur Degradation störender RNA enthält die Lösung meist zusätzlich eine RNase. Durch Zugabe einer Lösung von SDS und Natriumhydroxid werden die Zellen alkalisch lysiert. Die Zugabe von Eisessig und einer Kaliumacetat-Lösung bewirkt zum Einen eine Neutralisation und zum Anderen, mit Hilfe des in der zweiten Lösung enthaltenen SDS, dass die Proteine und die genomische DNA ausgefällt werden. Nach einer weiteren Zentrifugation wird die Plasmid-DNA meist einer Reinigung unterzogen z.B. einer Phenol-Chloroform-Extraktion. Die DNA kann dann mit einem Alkohol wie Isopropanol ausgefällt werden. Das Isopropanol entzieht der DNA die Hydrathülle. Mit 70 % Ethanol wird die gefällte DNA dann gewaschen und steht dann zur weiteren Verarbeitung zu Verfügung. Zur Vermessung der Konzentration im Photometer kann die DNA zum Beispiel in Wasser oder TRIS/EDTA-Puffer (pH 7,5) wieder gelöst werden.
Eine andere Aufschlussmethode stellt z. B. die sogenannte "Koch-Lyse" dar. Dabei werden die bakteriellen Zellwände durch Zugabe von Lysozym zerstört und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht. Die bakteriellen Abbauprodukte werden abzentrifugiert. Aus dem Überstand werden durch Zugabe von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bakterielle Proteine und Membranen denaturiert, während die Plasmid DNA in der wässrigen Phase bleibt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt zur Phasentrennung kann aus dem Überstand die Plasmid-DNA präzipitiert werden. Weiters können große Plasmide über CsCl-Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt werden.