Plaque-Assay
Ein {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) (frz. {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) [plak] für „Platte; Fleck; Schild“) ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen cytopathischen Viren, bei dem eine zu untersuchende Probe in unterschiedlichen Verdünnungen in eine Zellkultur eingebracht wird.
Prinzip
Aufgrund eines cytopathischen Effektes kommt es nach Infektion von Zellen mit Viruspartikeln (synonym Virionen) zur Lyse der Zellen und deren unmittelbaren Nachbarzellen. Nach Lyse dieser Zellen gelangen freigesetzte Viruspartikel wiederum in benachbarte Zellen, das Virus breitet sich dadurch immer weiter aus. So kommt es zu einem Fleck in einem konfluenten Zellrasen, in dem die Zellen lysiert wurden und den man als Lysishof oder {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) bezeichnet. Wird ein infizierter Zellrasen nach einer angemessenen Zeit, in der sich solche Plaques bilden konnten, fixiert, gefärbt und gewaschen, so erkennt man die Plaques als leere, nicht gefärbte Stellen, von denen sich die toten, lysierten Zellen beim Waschen teilweise abgelöst haben. Die Plaques werden gezählt und zusammen mit dem bekannten eingesetzten Volumen wird die Konzentration an infektiösen Viruspartikeln in der untersuchten Probe ermittelt, typischerweise als Infektiöse Einheiten je Milliliter, IE/ml, oder {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) je Milliliter, PFU/ml.
Im Gegensatz zur Konzentrationsbestimmung von Viren im Blut oder Serum im Sinne einer Viruslast mittels Nachweis der viralen DNA oder RNA durch PCR und eine evtl. vorangehende Reverse Transkription, werden beim {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) inaktivierte oder nicht-infektiöse Partikel innerhalb einer Viruspopulation nicht erfasst. Der {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) ist daher ein direktes Maß für die Konzentration infektiöser Partikel in einer Probe. Da jedoch nicht alle auf die Zellen gegebenen infektiösen Virionen auch (nach der Virenzugabe und vor der Polymerzugabe) zu einer Infektion führen, und nicht alle Viruspartikel weit genug voneinander entfernt auf den Zellrasen gelangen, werden im {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) tendenziell zu niedrige Werte ermittelt.
Zur Verbesserung der Genauigkeit der Methode können die Zellen nach der Infektion mit einem Polymer (z. B. {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value)[1] oder Zellulosepulver[2]) überschichtet werden. Diese Beschichtung verhindert während der drei Tage des Versuchs bei Stößen oder Vibrationen eine ungewollte Infektion von Zellen über das Kulturmedium und erlaubt nur direkte Infektionen von Nachbarzellen, da sonst möglicherweise über das Medium Plaques von Tochtervirionen der folgenden Generationen entstehen können und eine zu hohe Konzentration ermittelt würde.
Bei Viren, die keinen cytopathischen Effekt aufweisen, kann die Viruskonzentration über die {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) (TCID50) bestimmt werden.[3] Diese Methode basiert auf der Infektion der Zellkultur und einem beliebigen Nachweis (z. B. PCR), ob eine Zellkultur nach einem längeren Zeitraum (z. B. sieben Tage) überhaupt infiziert ist. Die Bestimmung der TCID50 umgeht das Problem der Infektion durch Tochtervirionen durch die Vermeidung einer Zählung von Plaques, da nur die Grenzverdünnungen ermittelt werden, bei der noch eine Infektion stattfindet.
Anwendungen
Mit dem {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) können nur Viruspartikel-Konzentration von Viren nachgewiesen werden, die eine verwendete Zelllinie infizieren können, darin replizieren und auch zur Lyse der Zellen führen. Der {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) kann bei lytischen Viren auch zur Bestimmung der Viruslast, eines Virustiters oder der minimalen Infektionsdosis verwendet werden.
Der {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) kann neben der Bestimmung der Konzentration infektiöser Virionen auch in einem Virus-Neutralisations-Assay (synonym Plaque-Reduktions-Assay) zum Nachweis infektionshemmender Antikörper gegen Teile des Virions dienen, wenn Viren in bekannter Konzentration mit einer auf neutralisierende Antikörper zu testenden Probe vorher inkubiert werden. Binden die Antikörper an jene Oberflächenepitope der Viren, die zur Aufnahme in die Zelle notwendig sind, so sieht man im {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) eine Verringerung der PFU/mL.[4]
Der Plaque-Assay wird auch genutzt, um die Wirkung von Desinfektionsmitteln zu untersuchen, bei denen das virale Genom nicht beeinträchtigt wird und unverändert nachweisbar bleibt, hingegen die Infektiosität der Virionen reduziert wird. Mit dem {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) kann auch untersucht werden, wie hoch die Konzentration von infektiösen Viren in einer gesammelten Probe oder nach einer Virusanzucht im Zellkulturmedium ist. Bei vielen Viren (insbesondere RNA-Viren) ist nur ein geringer Prozentsatz der freigesetzten Virionen auch tatsächlich infektiös.
Der Vorläufer des {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) erfasste bei Influenzaviren anhand der Veränderung des Amnions infizierter embryonierter Hühnereier die Anzahl {{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value) pro Milliliter.
Literatur
- H. L. Bachrach, J. J. Callis et al.: A plaque assay for foot-and-mouth disease virus and kinetics of virus reproduction. Virology (1957) 4(2): S. 224-36 PMID 13496542
- P. D. Cooper: The plaque assay of animal viruses. Adv Virus Res (1961) 8: S. 319-78 PMID 13881155
Einzelnachweise
- ↑ C. R. Gaush, T. F. Smith: Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16(4):588-94 (1968). PMID 5647517.
- ↑ M. Matrosovich, T. Matrosovich, W. Garten, H. D. Klenk: New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3:63 (2006). PMID 16945126.
- ↑ Y. Gao, I. Nankya, A. Abraha, R. M. Troyer, K. N. Nelson, A. Rubio, E. J. Arts: Calculating HIV-1 Infectious Titre Using a Virtual TCID50 Method. Methods in Molecular Biology Vol. 485 Page 27-35 (2008). PMID 19020816.
- ↑ M. de Graaf, S. Herfst, E. J. Schrauwen et al.: An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus. J Virol Methods 143(2): S. 169-74 (2007). PMID 17420056.