Affilin

3D-Strukturmodell eines Affilins auf Gamma-Kristallin-B-Basis (nach PDB 2JDG).

Affiline sind künstliche Proteine, die zur Bindung von Antigenen befähigt sind. Affiline sind strukturell vom menschlichen Ubiquitin oder von menschlichen Gamma-Kristallinen abgeleitet. Sie werden durch Veränderung ihrer oberflächennahen Aminosäuren gewonnen und mit Hilfe sogenannter Displaytechniken isoliert. Affiline besitzen sowohl Eigenschaften von Antikörpern als auch die von niedermolekularen Substanzen und werden daher als Antikörpermimetika bezeichnet. Affiline werden derzeit als mögliche neuartige biopharmazeutische Arzneistoffe untersucht und entwickelt.

Struktur

Als Grundgerüst für die Entwicklung von Affilinen wurden sowohl Gamma-Kristallin B als auch Ubiquitin beschrieben. Charakteristisch für beide Typen von Affilinen ist eine Bindungsregion innerhalb einer β-Faltblatt-Struktur. Sie unterscheiden sich somit von Antikörpern, deren Bindungsregion in flexiblen Schleifenregionen, den Complementarity Determining Regions (CDRs), lokalisiert ist.

Gamma-Kristallin-B-basierte Affiline

Gamma-Kristallin-B-basierte Affiline sind vom Augenlinsen-Strukturprotein Gamma-Kristallin B abgeleitet. Dieses Protein mit einer Molekülmasse von etwa 20 kDa besteht aus zwei strukturell identischen Proteindomänen mit β-Faltblatt-Struktur.^[1] Die acht oberflächennahen Aminosäuren 2, 4, 6, 15, 17, 19, 36 und 38 können durch andere ausgetauscht werden.^[2]

Ubiquitin-basierte Affiline

Ubiquitin-basierte Affiline sind von dem ubiquitär vorkommenden etwa 76 Aminosäuren langen Protein Ubiquitin abgeleitet. Dieses besteht aus dreieinhalb alpha-helikalen Windungen und einem aus fünf Strängen aufgebauten, antiparallelen β-Faltblatt.^[3] Die oberflächennahen Aminosäuren 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 und 66 befinden sich in räumlicher Nähe zueinander am Beginn des ersten N-terminalen β-Faltblattstrangs, in der Schleife oder am Beginn des C-terminalen β-Faltblattstrangs und bilden mit ihren Seitenketten einen zusammenhängenden Bereich auf der Oberfläche des Ubiquitins. Diese Aminosäuren können in den etwa 10 kDa großen Ubiquitin-basierten Affilinen gegen andere ausgetauscht sein.^[4]

Eigenschaften

Affiline besitzen eine etwa acht mal bzw. 16 mal kleinere Molekülmasse als Antikörper vom IgG-Typ. Basierend darauf besitzen sie eine gegenüber Antikörpern erhöhte Gewebepermeabilität. Andererseits ermöglicht die geringe Molekülmasse eine Ausscheidung über die Nieren und führt zu einer verkürzten Plasmahalbwertzeit. Ihre pH-Stabilität ermöglicht eine Darmpassage. Affiline sind zudem bis 90 °C temperaturstabil.

Herstellung

Die Herstellung von Affilinen gegen ein spezifisches Zielprotein umfasst mehrere Schritte. Ausgangspunkt ist die Generierung einer Affilin-Molekülbibliothek. Diese Affilinbibliothek wird durch Substitution der der acht austauschbaren oberflächennahen Aminosäuren von Gamma-Kristallin B oder Ubiquitin mit Hilfe der zufälligen Mutagenese generiert. Bei Verwendung der proteinogenen Aminosäuren mit Ausnahme von Cystein kann die Bibliothek eine Komplexität von bis zu 17 Milliarden verschiedenen Molekülen erreichen. Bei einer Randomisierung von 14 Positionen in einem Affilindimer sind sogar etwa 10¹⁹ verschiedene Moleküle in einer Dimerbibliothek denkbar.

Nach der Generierung einer Affilinbibliothek werden aus dieser einzelne Affiline selektiert, welche das Zielprotein binden. Für die Selektion werden Displaytechniken, wie beispielsweise das Phagendisplay oder das Ribosomendisplay, eingesetzt. Die so selektierten Affiline werden isoliert und weiter biochemisch, pharmakologisch und biophysikalisch charakterisiert.

Nach einer Selektion von Affilinen können diese durch weitere Veränderungen optimiert werden. Eine Di- oder Multimerisierung kann dank des Aviditätseffekts eine Steigerung der Bindungsaffinität zum Zielmolekül und zugleich eine Verlängerung der Plasmahalbwertzeit bewirken. Weitere Optionen sind Konjugationen mit Radionukliden, Zytotoxinen oder Zytokinen.

Die großtechnische Herstellung von Affilinen kann mit Hilfe der in der Biotechnologie gebräuchlichen Produktionsorganismen, wie beispielsweise E. coli, erfolgen.

Literatur

• Hey T, Fiedler E, Rudolph R, Fiedler M: Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial applications. In: Trends Biotechnol. 23. Jahrgang, Nr. 10, Oktober 2005, S. 514–22, doi:10.1016/j.tibtech.2005.07.007, PMID 16054718. 
• Ebersbach H, Fiedler E, Scheuermann T, et al.: Affilin-novel binding molecules based on human gamma-B-crystallin, an all beta-sheet protein. In: J. Mol. Biol. 372. Jahrgang, Nr. 1, September 2007, S. 172–85, doi:10.1016/j.jmb.2007.06.045, PMID 17628592. 

Weblinks

• Website des Affilin-Herstellers Scil Proteins GmbH

Einzelnachweise