Dichtegradientenzentrifugation
Die Dichtegradientenzentrifugation gehört zu den physikalischen Trennverfahren. Verschiedene gelöste Makromoleküle werden in einer Ultrazentrifuge anhand ihrer Bewegungsgeschwindigkeit (siehe auch Sedimentationsgeschwindigkeit) unter dem Einfluss starker Zentrifugalkräfte sortiert.
Dabei hängt die Bewegungsgeschwindigkeit ab von
- der Winkelgeschwindigkeit des Rotors
- dem Abstand des Maximums des Konzentrationsgradienten vom Rotorzentrum
- den Moleküleigenschaften
- der Dichte des Lösungsmittels
- der Viskosität des Lösungsmittels.
Die zu untersuchende Probe wird auf die Oberfläche des Zentrifugenröhrchens gegeben. Während der mehrstündigen Trennung sedimentieren die Moleküle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit im Lösungsmittel, und zwar solange die Dichte der Probe größer ist als die Dichte des Lösungsmittels und umso schneller, je größer der Dichteunterschied ist. Bricht man die Zentrifugation zu einem geeigneten Zeitpunkt ab, erhält man unterschiedliche Banden der Bestandteile der Probe.
Für ein trennscharfes Ergebnis müssen die einzelnen Banden gegen eine Vermischung durch Konvektion geschützt werden. Dies wird erreicht, indem das Zentrifugenglas mit einem schwach ansteigenden Gradienten einer Salzlösung gefüllt wird. Dabei liegt die höchste Dichte am Boden des Zentrifugenglases, und jeder Bereich hat eine größere Dichte als der unmittelbar darüber liegende.
In einem solchen System stellt sich für jede Molekülsorte ein Gleichgewicht von Sedimentation und Diffusion ein, und man kann sie an einer definierten Stelle des Zentrifugenglases entnehmen.
Für jede Molekülsorte kann eine Sedimentationskonstante K bestimmt werden. Sie ist als Quotient von Sedimentationsgeschwindigkeit und Zentrifugalbeschleunigung definiert und wird als Svedberg-Einheit (S) angegeben.
Biologie, Medizin
In beiden Disziplinen wird ein ähnliches Verfahren benutzt, um verschiedene Zelltypen bzw. die Bestandteile aufgebrochener Zellen aufgrund ihrer Schwebedichte zu trennen. Man arbeitet hier mit steilen Gradienten von Rohrzucker (Saccharose) bzw. Cäsiumchlorid. Als weitere Trennlösungen kommen synthetische Polymere aus Saccharose (Ficoll) oder Kieselgel (Percoll) zum Einsatz. Im einfachsten Fall reduziert sich der Gradient auf nur eine Dichtestufe, die durch vorsichtiges Übereinanderschichten zweier Lösungen unterschiedlicher Dichte aufgebaut wurde. Die zentrifugierten Zellen oder Zellbestandteile sammeln sich in diesem Fall an der Grenzschicht zwischen beiden Schichten.
Für die Dichtegradientenzentrifugation sind Rotoren mit ausschwingenden Röhrchenhaltern besser geeignet, als Rotoren mit starren Röhrchenhaltern. In jedem Falle ist es aber günstig, am Ende der Zentrifugation den Rotor ungebremst auslaufen zu lassen, um den Dichtegradienten nicht zu verwirbeln.
Begriffsdefinitionen
Grundsätzlich gibt es zwei unterschiedliche Methoden der Dichtegradientenzentrifugation:
- Die Trennung nach Sinkgeschwindigkeit, beziehungsweise nach zurückgelegter Strecke nach einer bestimmten Zeit. Ein Beispiel dafür wären ribosomale Untereinheiten in einem Gradienten aus Rohrzucker. Dabei verbreitern sich die Banden im Laufe der Zeit durch die Diffusion. Nach sehr langer Zeit würden alle ribosomalen Untereinheiten auf dem Boden des Röhrchens landen.
- Die Trennung nach gleicher Dichte, die isopyknische Zentrifugation. Ein Beispiel dafür wären Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid in einem Gradienten aus Cäsiumchlorid. Nur bei der isopyknischen Zentrifugation werden die Banden im Laufe der Zeit immer schärfer, und bleiben auch nach sehr langer Zeit an derselben Stelle des Röhrchens.