Ethidiumbromid

Strukturformel
Struktur des Ethidium-Ions     Struktur des Br--Ions
Allgemeines
Name Ethidiumbromid
Andere Namen
  • Homidiumbromid (INN)
  • Homidium
  • Ethidium®
  • Novidium®
  • 3,8-Diamino-5-ethyl- 6-phenyl-phenanthridiniumbromid
Summenformel C21H20BrN3
CAS-Nummer 1239-45-8
PubChem 14710
Kurzbeschreibung

roter Feststoff[1]

Eigenschaften
Molare Masse 394,32 g·mol−1
Aggregatzustand

fest

Schmelzpunkt

260–262 °C [2]

Löslichkeit

löslich in Wasser (40 g·l−1 bei 25 °C) [2]

Sicherheitshinweise
GHS-Gefahrstoffkennzeichnung aus EU-Verordnung (EG) 1272/2008 (CLP) [3]
06 – Giftig oder sehr giftig 08 – Gesundheitsgefährdend

Gefahr

H- und P-Sätze H: 341-330-302
P: 281-​302+352-​305+351+338-​304+340-​309-​310Vorlage:P-Sätze/Wartung/mehr als 5 Sätze [2]
EU-Gefahrstoffkennzeichnung aus EU-Verordnung (EG) 1272/2008 (CLP) [3]
Sehr giftig
Sehr giftig
(T+)
R- und S-Sätze R: 22-26-68
S: (1/2)-28-36/37-45-63
LD50
Soweit möglich und gebräuchlich, werden SI-Einheiten verwendet. Wenn nicht anders vermerkt, gelten die angegebenen Daten bei Standardbedingungen.
Vorlage:Infobox Chemikalie/Summenformelsuche vorhanden


Ethidiumbromid (EtBr), auch Ethidium oder Homidium genannt, ist ein roter Phenanthridin-Farbstoff, der in der Molekularbiologie zum Nachweis der Nukleinsäuren, DNA und RNA, verwendet wird.[6] Ethidiumbromid ist das homologe Ethylderivat von Dimidiumbromid.

Geschichte

Auf der Suche nach neuen Wirkstoffen gegen Trypanosomen-Erkrankungen wurde Ethidiumbromid 1938 von Carl Hamilton Browning synthetisiert (Substanz Nr. 897). Ethidiumbromid zeigte antitrypanosomale Aktivität gegen Trypanosoma congolense Infektionen bei Mäusen und Rindern.[7] Ethidiumbromid wurde 1952 unter dem Handelsnamen Ethidium® auf den Markt gebracht und extensiv in den 1960er und 1970er Jahren zur Behandlung und Prophylaxe von Infektionen mit Trypanosomen bei Rindern genutzt. Zu diesem Zweck wird Ethidiumbromid bis heute eingesetzt; eine Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht dient sowohl der Behandlung infizierter Tiere als auch der Infektionsprophylaxe, die bis zu 3 Monate anhält.

1965 wurde entdeckt, dass Ethidiumbromid an DNA bindet[8] und dass sich dabei sein Absorptionsspektrum verändert[9]. 1972 wurde Ethidiumbromid erstmals zum Anfärben von DNA in Gelelektrophoresen eingesetzt.[10][11][12]

Eigenschaften

Absorptionsspektrum von Ethidiumbromid in Wasser.

Das Absorptionsspektrum von Ethidiumbromid in Wasser zeigt zwei Absorptionsbanden im UV-Bereich (λ = 210 nm, ε = 40000; λ = 285, ε = 50000) mit zwei Schultern (λ = 316 nm, ε = 5000–10000; λ = 343 nm, ε = 200–500) und eine im sichtbaren Bereich (λ = 480 nm, ε = 5300).[13][14]

Ethidiumbromid interkaliert in Nukleinsäuren und verändert dabei sein Absorptionsspektrum. Das Emissionsspektrum bleibt nahezu unverändert. Durch die Interkalation von Ethidiumbromid in Nukleinsäuren nimmt die Intensität der Fluoreszenz-Emission um den Faktor 50–100 zu.

Verwendung

Ethidiumbromid wird in der Molekularbiologie zum Anfärben von Nukleinsäuren bei der Gelelektrophorese verwendet. Einzelne Ethidiumbromid-Moleküle interkalieren dabei zwischen die Basen der DNA bzw. RNA (Einlagerung im Abstand von 10 Basenpaaren), wodurch sich das Anregungsspektrum von Ethidiumbromid verändert und so die Fluoreszenz der Substanz bei Anregung mit ultraviolettem Licht stark erhöht wird. Auf diese Weise leuchten im Agarosegel die Stellen, an denen sich Nukleinsäuren befinden, hell auf, während Stellen ohne Nukleinsäuren dunkel erscheinen.[15] Die Lichtintensität ist dabei proportional zur vorliegenden DNA/RNA-Konzentration, sowie zur Länge der Nukleinsäure. Die verwendete Ethidiumbromid-Konzentration im Agarosegel liegt üblicherweise bei 0,1–0,5 µg/ml.

In der Durchflusszytometrie wird Ethidiumbromid zur Bestimmung der Zellviabilität verwendet.

Ethidiumbromid inhibiert in niedrigen Konzentrationen (0,1–2 µg/ml) spezifisch die Replikation der mitochondrialen DNA (mtDNA) in Eukaryoten. Es wird daher zur Generierung mtDNA-defizienter Zellen (rho zero cells, ρ0) verwendet.

Alternativen

Um sich nicht den Gefahren von Ethidiumbromid auszusetzen, können Alternativen, wie zum Beispiel SYBR Green I oder SYBR Gold, verwendet werden.[16] Solche sind jedoch sehr teuer und deren Toxizität und Mutagenität unbekannt, so dass in vielen Labors immer noch Ethidiumbromid als Färbemittel eingesetzt wird.

Weitere Alternativen sind Methylenblau, Nilblau A, Acridinorange.

Risiken

Die Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe hat im Jahresbericht 2005 Ethidiumbromid als krebsverdächtigen Arbeitsstoff der Kanzerogenitäts-Kategorie 3B zugeordnet. Der Verdacht einer mutagenen Wirkung auf Keimbahnzellen wird als „begründet“ eingestuft.[17] Im National Toxicology Program (Executive Summary) des NIH wird dazu bemerkt, dass kein Fall bekannt ist, wo Ethidiumbromid tatsächlich einen Tumor ausgelöst hätte. In vivo Untersuchungen des National Toxicology Program an Ratten und Mäusen konnten keinerlei krebserzeugende Wirkung nachweisen. Stattdessen gab es einige Studien zu Beginn der 1970er Jahren, in denen eine antitumorgene Wirkung von Ethidiumbromid beschrieben wurde.[18][19] In einer aktuelleren Studie konnte gezeigt werden, dass EtBr als Topoisomerase 1-Gift wirkt, vergleichbar mit diversen Zytostatika, welche zur Krebsbehandlung von Menschen eingesetzt werden.[20] Eine subchronische Karzinogenitätsstudie in Mäusen, welche an der Universität Düsseldorf durchgeführt wurde, konnte ebenfalls keine mutagenen Effekte nachweisen.[21]

Ethidiumbromid wirkt erst in sehr hohen Konzentrationen akut toxisch. Die LD50 von Ethidiumbromid für Ratten bei oraler Applikation wird mit 1503 mg/kg Körpergewicht angegeben.[5]

Sicherheit

Ethidiumbromid ist möglicherweise erbgutverändernd. Die Verwendung von Handschuhen im Umgang mit Ethidiumbromid oder mit Ethidiumbromid-gefärbten Gelen ist dringend angezeigt, da Ethidiumbromid über die Haut resorbiert wird. Untersuchungen der Abteilung Arbeitssicherheit der Universität Freiburg haben gezeigt, dass die in Laboren üblichen dünnwandigen Einmalhandschuhe aus Latex bereits nach sehr kurzer Zeit von Ethidiumbromid durchdrungen werden (1%ige Lösung: ca. 30 s; 0,1%ige Lösung: ca. 60 s). Handschuhe aus Nitril zeigten beim Test unter denselben Bedingungen keine nachweisbare Durchdringung und sind daher vorzuziehen. Latexhandschuhe sollten allenfalls als kurzfristiger Spritzschutz Verwendung finden.

Die Verwendung von gebrauchsfertigen Lösungen, beispielsweise einer Konzentration von 10 mg/ml in Wasser, wird empfohlen, um Staubentwicklung zu vermeiden.

Für Ethidiumbromid ist kein MAK-Wert festgelegt, da für krebserzeugende Arbeitsstoffe, krebsverdächtige Stoffe und Mutagene keine Wirkungsgrenzen ermittelt werden können.

Entsorgung

Ethidiumbromidhaltige Abfälle dürfen nicht ins Abwasser gelangen und müssen vor der Entsorgung inaktiviert werden, z. B. durch Adsorption des Ethidiumbromids an Aktivkohle (1 mg Aktivkohle adsorbiert ca. 50 µl einer frisch angesetzten 1 %igen EtBr-Lösung). Das ethidiumbromidfreie Eluat wird meist über den Ausguss entsorgt. Die beaufschlagte Aktivkohle wird entweder im Muffelofen ausgeglüht (Pyrolyse) oder als fester Sonderabfall getrennt gesammelt. Fertige Adsorber sind kommerziell erhältlich.

Sonstiges

Hinweis zur Abkürzung: die in den Biowissenschaften regelmäßig verwendete Abkürzung EtBr für Ethidiumbromid kann in chemischem Zusammenhang zu Verwechselungen führen. In der organischen Chemie ist Et die auch in internationalen Publikationen anerkannte Abkürzung für die Ethylgruppe –CH2–CH3, somit steht EtBr in der Chemie für Ethylbromid.

Einzelnachweise

  1.  Thieme Chemistry (Hrsg.): RÖMPP Online – Version 3.5. Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 2009.
  2. 2,0 2,1 2,2 Eintrag zu Ethidiumbromid in der GESTIS-Stoffdatenbank des IFA, abgerufen am 31. Jan. 2007 (JavaScript erforderlich)
  3. 3,0 3,1
  4. Ethidiumbromid bei ChemIDplus
  5. 5,0 5,1 ChemDAT. Die Merck Chemie Datenbank.
  6. Mikrobiologische Charakterisierung aquatischer Semente: Methodensammlung, S. 47–58, Oldenbourg Verlag, ISBN 3-486-26435-4.
  7. Browning, C.H. et al. (1938): The trypanocidal action of certain phenanthridinium compounds. In: J. Path. Bact. Bd. 46, S. 203–204. doi:10.1002/path.1700460121
  8. Waring, M.J. (1965): Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids. In: J. Mol. Biol. Bd. 13, S. 269–282. PMID 5859041
  9. Le Pecq, J.B. and Paoletti, C. (1966): A new fluorometric method for RNA and DNA determination. Anal. Biochem. Bd. 17, S. 100–107. PMID 6008008
  10. Borst, P. (2005): Ethidium DNA agarose gel electrophoresis: how it started. In: IUBMB Life. Bd. 57, S. 745–747. PMID 16511967
  11. Aaij, C. und Borst, P. (1972): The gel electrophoresis of DNA. In: Biochim. Biophys. Acta. Bd. 269, S. 192–200. PMID 5063906
  12. Sharp, P.A., Sugden, B., Sambrook, J. (1973): Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose – ethidium bromide electrophoresis. In: Biochemistry. Bd. 12, S. 3055–3063. PMID 4354250
  13.  Bruce Hudson, Russell Jacobs: The ultraviolet transitions of the ethidium cation. In: Biopolymers. 14, Nr. 6, 1975, S. 1309-1312, doi:10.1002/bip.1975.360140619.
  14. CAS Registry Number: 1239-45-8. In: National Toxicology Program. U.S. Department of Health and Human Services, abgerufen am 16. April 2009 (englisch).
  15. M. Holtzhauer: Biochemische Labormethoden, S. 51, 3. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 2009, ISBN 3-540-62435-X.
  16. Huang, Q. and Fu, W.L. (2005): Comparative analysis of the DNA staining efficiencies of different fluorescent dyes in preparative agarose gel electrophoresis. In: Clin. Chem. Lab. Med. Bd. 43, S. 841–842. PMID 16201894
  17. Senatskommission der Deutsche Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe. Jahresbericht 2005. PDF
  18. National Toxicology Program: Testing Status: Ethidium bromide
  19. National Toxicology Program: Executive Summary: Ethidium Bromide
  20. Gentry AC, Juul S, Veigaard C, Knudsen BR, Osheroff N.: The geometry of DNA supercoils modulates the DNA cleavage activity of human topoisomerase I.. In: Nucleic Acids Research. 39, Nr. 3, 2011, S. 1014-1022. doi:10.1093/nar/gkq822.
  21. Marossek V (18. Dezember 2001): Identifizierung und Charakterisierung molekularbiologischer Veränderungen am Beispiel des Tumorsuppressors p53 in der Tamoxifen- bzw. Bromdeoxyuridin-induzierten Karzinogenese im Labornager.. Abgerufen am 8. September 2011.

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