RACE-PCR
Als RACE-PCR (englisch rapid amplification of cDNA-ends with polymerase chain reaction) wird in der Molekularbiologie eine Technik zur schnellen Vervielfältigung von cDNA-Enden mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet.
Das Ziel von RACE-PCRs liegt in der Isolation von Gen-Enden und ist eine Abwandlung der RT-PCR. Die Gen-Enden werden bei der Transkription ebenso wie die kodierenden Bereiche in RNA übersetzt und bilden die untranslatierten Regionen (UTR) des Transkripts. Wohingegen der Start- und Endpunkt der kodierenden Sequenz von Genen leicht mit Hilfe der DNA-Sequenz zu bestimmen ist, sind die Genenden nicht leicht zu definieren. Die untranslatierten Regionen enthalten jedoch wichtige regulatorische Elemente, die die Translation der mRNA und deren Stabilität beeinflussen und sind daher von großem Interesse.[1][2][3]
Methoden
Mittels der hier beschriebenen RACE lässt sich die Sequenz der untranslatierten Bereiche einer cytoplasmatischen mRNA ermitteln. Ausgehend von einer kurzen bekannten Sequenz in der kodierenden Region des Transkripts kann das 5'-Ende (5'-RACE-PCR) oder 3'-Ende (3'-RACE-PCR) der mRNA untersucht werden. Cytoplasmatische mRNA-Moleküle besitzen einen poly(A)-Schwanz, der als Ausgangspunkt für die 3'-RACE genutzt werden kann. Für die 5'-RACE muss an das 5'-Ende der mRNA ein Adapter ligiert werden. Voraussetzung beider Methoden ist eine cDNA-Synthese und Amplifikation der cDNA Fragmente mittels PCR. Auf Grund der durchschnittlichen Länge der 3'UTR von 770 Nukleotiden (nt) ist diese Methode anspruchsvoller als die 5'RACE, bei der die 5'UTR von nur etwa 300 nt untersucht wird (Mensch: 5' ca. 150 nt, 3' > 500 nt [2]).
3'-RACE
Als Startpunkt für die cDNA-Synthese für die anschließende 3'-RACE (sprich: 3 prime race) dient der poly(A)-Schwanz einer eukaryotischen cytoplasmatischen mRNA. An diesen wird ein Oligonukleotid (Primer) angelagert, das aus einem oligo(dT)-Strang und einer bekannten Ankersequenz besteht. Der oligo(dT) Primer lagert sich an den poly(A)-Schwanz an und wird als Ausgangspunkt für die cDNA-Synthese genutzt - der Anker "steht 5' über". Anschließend wird die RNA durch RNase H degradiert. Die gewonnene cDNA wird als Vorlage in einer PCR genutzt werden. Hierzu nutzt man einen Primer, der im (bekannten) kodierenden Bereich des untersuchten Gens bindet, und dem Anker, der während der cDNA Synthese angefügt wurde. Das Amplifikat kann anschließend weiter untersucht, z.B. sequenziert, werden.
5'-RACE
Bei der 5'-RACE startet die cDNA-Synthese mit einem Primer, der in Gegensinn-Richtung (antisense) im kodierenden Bereich der zu untersuchenden mRNA bindet. Die gebildete cDNA enthält somit einen Teil der kodierenden Sequenz und die vollständige 5'UTR. Daraufhin wird mit einer terminalen Nukleotidyltransferase und dATP ein eigenes poly(A)-Ende an das cDNA-Molekül angehängt. Anschließend wird die mRNA mit Hilfe von RNase H degradiert. Das Produkt dient als Vorlage einer PCR-Reaktion. Hierbei werden der geninterne Primer und zwei sense Primer verwendet. Der erste sense-Primer besteht aus einer oligo(dT)- und Anker-Sequenz, der Zweite nur aus der Anker-Sequenz. Mit Hilfe des ersten Primers wird der Anker an die PCR-Produkte angefügt, der Zweite sorgt für eine spezifische Amplifikation während der PCR.[4] Das Amplifikat kann wie bei der 3'-RACE anschließend weiter untersucht, z.B. sequenziert, werden.
RLM-RACE
Die sogenannte Capfinder-Strategie der RACE (auch RLM-RACE, RNA ligase mediated RACE) dient zur Untersuchung des vollständigen 5'-Endes der cDNA. Hierfür werden zuerst RNA-Bruchstücke, die freie 5' Phosphatenden tragen durch Alkalische Phosphatase (calf intestine phosphatase, CIP) dephosphoryliert. Nur durch capping geschützte mRNAs sind hiervon nicht betroffen. Im zweiten Schritt werden die Caps mit Hilfe einer Nikotinsäure-Pyrophosphatase (tobacco acid pyrophoshatase, TAP) abgespalten, wobei das 5'-α-Phosphat erhalten bleibt. Mit Hilfe der T4-RNA-Ligase wird dann ein RNA-Adapter-Oligonukleotid mit bekannter Sequenz an die mRNA ligiert. Anschließend kann mit einem antisense Primer eine cDNA-Synthese durchgeführt werden. Darauf folgt eine PCR mit dem zur cDNA-Synthese genutzten Primer und dem am 5' Ende angefügten Adapter-Primer.
SMART-RACE
Bei der SMART-RACE (switching mechanism at 5' end of RNA transcript) wird die gesamte mRNA von einem Oligo(dT)-Primer aus in cDNA umgeschrieben. An das 3'-Ende der cDNA (entspricht dem 5'-Ende der mRNA) wird ein Oligo(dC) angefügt. Mit Hilfe eines Ankerprimers mit einem passenden Oligo(dG) und einem Oligo(dA)-Ankerprimer für das 3'-Ende wird dann eine PCR durchgeführt. Die weitere Untersuchung verläuft analog zu den anderen RACE-Methoden.
Literatur
- Frohman, M. A. (1993): Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. In: Methods Enzymol. 218: 340-356. PMID 7685466
- ↑ Pickering, B.M. & Willis, A.E. (2004): The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. In: Semin Cell Dev Biol. Bd. 16, S. 39-47. PMID 15659338
- ↑ 2,0 2,1 Mazumder, B. et al. (2003): Translational control by the 3'-UTR: the ends specify the means. In: Trends Biochem. Sci. Bd. 28, S. 91-98. PMID 12575997 doi:10.1016/S0968-0004(03)00002-1
- ↑ Scotto–Lavino E., Du G. & Frohman M.A. (2007): 3' End cDNA amplification using classic RACE In: Nature Protocols Bd 1, S. 2742-2745 doi:10.1038/nprot.2006.481
- ↑ Nature Methods 2, 629 - 630 (2005) doi:10.1038/nmeth0805-629
Siehe auch
- RT-PCR