Autoradiographie

Autoradiogramm eines Schnitts durch das Gehirn eines Rattenembryos. Die Markierung erfolgte mit Oligonukleotid-Sequenzen, die mit ³⁵S-dATP (Desoxyadenosintriphosphat) konjugiert waren und an GAD67 (Glutamatdecarboxylase 67) binden. Die Bereiche mit hoher Radioaktivität (hohe Markerkonzentration) sind schwarz. Dies ist insbesondere in der subventrikulären Zone (SVZ) der Fall. Der schwarze Maßstabsbalken entspricht einer Länge von 2 mm.

Autoradiographie oder Radiographie (häufige Abkürzung AURA) bezeichnet die Sichtbarmachung einer chemischen Komponente durch radioaktive Isotope, ursprünglich durch Schwärzung eines fotografischen Filmes, inzwischen vermehrt mit Hilfe eines Strahlungsdetektors. Die dabei erhaltene Aufnahme wird Autoradiogramm genannt.

Anwendungen

Die Autoradiographie war über drei Jahrzehnte hin ein integraler Bestandteil der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger. Seit den letzten Jahren des 20. Jahrhunderts werden allerdings vermehrt fluoreszierende anstelle von radioaktiv markierten DNA-Nukleotiden zur Sequenzanalyse benutzt.

Autoradiographie findet weiterhin Verwendung bei der Produktion von rekombinanten Proteinen, Analyse von enzymatischen Reaktionen, oder Identifizierung von Enzym-Substraten.

Außerdem wird sie in der Pharmakokinetik angewendet, um Liberation Absorption Distribution Metabolism Excretion-Studien (LADME) zu erstellen.

Durchführung

Allen Anwendungen der Autoradiographie gemeinsam ist die Notwendigkeit, radioaktive Isotope in die zu analysierenden Moleküle einzuschleusen. Aufgrund des häufigen Vorkommens der korrespondierenden stabilen Isotope in Biomolekülen und ihrer relativ geringen Gefährlichkeit werden häufig die Radioisotope ¹⁴C (Kohlenstoff), ³⁵S (Schwefel), ³²P (Phosphor) und ³H (Tritium) eingesetzt.

1. Beispiel – Markierung rekombinanter Proteine

Ein mit einem Expressionsplasmid transformierter Bakterienstamm wird mit einem Nährmedium versetzt, das die radioaktiv markierte Aminosäure ³⁵S-Methionin enthält. ³⁵S-Methionin wird in das rekombinante Protein, das auf dem Plasmid kodiert ist, eingebaut. Ein Bakterienextrakt wird per SDS-PAGE aufgetrennt, das Gel wird getrocknet, und ein Film wird aufgelegt. Nach „Belichtung“ des Films durch die von den Isotopen ausgehenden Betastrahlen ist auf dem entwickelten Film die Position des rekombinanten Proteins sichtbar.

2. Beispiel – Analyse von Enzymaktivität

Eine ATPase, also ein Enzym, das das Nukleotid ATP spaltet, wird mit radioaktiv markiertem ³²P-ATP inkubiert. Die Mischung wird nach unterschiedlichen Zeiten durch Dünnschichtchromatografie aufgetrennt, die Chromatographieplatte wird getrocknet und auf Film gelegt. Die Schwärzung des Films durch ³²P-Phosphat spiegelt die Aktivität des Enzyms wider.