Grün fluoreszierendes Protein

Visualisierung der Zellmembran von Hefezellen mit GFP- und RFP-Fusionsproteinen

Illustration von acht verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (BFP, mTFP1, Emerald, Citrine, mOrange, mApple, mCherry und mGrape) in Bakterien

Das grün fluoreszierende Protein (Abkürzung GFP; engl. green fluorescent protein) ist ein erstmals 1961 von Osamu Shimomura^[1][2] beschriebenes Protein aus der Qualle Aequorea victoria, das bei Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht grün fluoresziert. Seine unschätzbare Bedeutung in der Biologie, insbesondere der Zellbiologie, liegt in der Möglichkeit, GFP mit beliebigen anderen Proteinen Gen-spezifisch zu fusionieren. Durch die Fluoreszenz des GFP kann so die räumliche und zeitliche Verteilung des anderen Proteins in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen direkt beobachtet werden.

Im Jahr 2008 wurde der Nobelpreis für Chemie für die „Entdeckung und Weiterentwicklung des grün fluoreszierenden Proteins“ an Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien verliehen.

Eigenschaften

Die Primärstruktur besteht aus 238 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von 26,9 kDa.^[3] Der eigentliche Fluorophor des GFP bildet sich offenbar autokatalytisch aus der Tripeptidsequenz Ser₆₅–Tyr₆₆–Gly₆₇ innerhalb der Polypeptidkette. Diese Fluoreszenz basiert nicht auf einem Umbau durch ein externes Enzym oder nachträglich integrierte Substanzen, kommt also vollständig ohne eventuell zellspezifische Prozessierungssysteme aus.

In seinem Ursprungsorganismus erhält GFP seine Anregungsenergie durch strahlungsfreien Energietransfer vom Photoprotein Aequorin. In Anwendungen wird GFP immer optisch angeregt. Das unmodifizierte, natürlich vorkommende GFP hat zwei Anregungsmaxima. Das erste liegt bei einer Wellenlänge von 395 nm, das zweite bei 475 nm. Die Emissionswellenlänge liegt bei 509 nm.

Anwendung

Links und rechts je eine GFP-Maus unter UV-Licht. In der Mitte eine Maus ohne GFP.^[4]

Douglas Prasher isolierte, klonierte und sequenzierte 1992 die cDNA von GFP.^[5] Seit es Prasher 1994 gelang, GFP als Marker für andere Proteine zu benutzen, ist diese Technik in wenigen Jahren zu einer Standardmethode der Zellbiologie geworden.^[6] Zur Herstellung von GFP-Fusionsproteinen wird die DNA des zu untersuchenden Proteins mit der GFP-DNA verbunden und in eine Form gebracht (siehe Vektor), die von der Zelle aufgenommen werden kann, so dass sie das Fusionsprotein selbstständig herstellt (Transfektion/oder Transformation bei nicht Zellkulturen). In vielen Fällen wird das zu untersuchende Protein noch an die korrekte Stelle in der Zelle transportiert, und das GFP kann durch Fluoreszenzmikroskopie Aufschluss über die zeitliche und räumliche Lokalisation des Zielproteins in der Zelle geben.

GFP ist in nahezu allen eukaryotischen Zellen als nicht-toxisch einzustufen und eignet sich daher perfekt für die Untersuchung biologischer Prozesse in vivo. Einziges Problem kann bei sehr hoher Expression die Bildung von Peroxid bei der Entstehung des Fluorophors sein, welches die Zelle unter Stress setzen und schädigen könnte.

Moderne Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, wie Vertico-SMI, STED-Mikroskopie, 3D-SIM-Mikroskopie und Photoactivated Localization Microscopy können mit GFP-Derivaten bzw. photoaktivierbaren fluoreszierenden Proteinen markierte Strukturen über die optische Auflösungsgrenze hinaus auflösen.

Auch von Labormethoden abweichende Anwendungen, wie z. B. ein Leuchtkaninchen oder ein in den USA im Tierhandel unter dem Namen GloFish erhältlicher, genetisch manipulierter Zebrabärbling (Danio rerio) sind zu finden.^[7]

Varianten

Mittlerweile gibt es diverse modifizierte Versionen des Original-GFP, die andere Fluoreszenzspektren aufweisen. Entsprechend der Farbe heißen diese zum Beispiel CFP (cyan) oder YFP (yellow). Bei geschickter Anwendung sind einzelne Zellorganellen unterschiedlich einfärbbar und mittels Entmischung (spektrale Dekonvolution) dann getrennt beobachtbar. Als entscheidend ist auch noch die Entwicklung von enhanced-Varianten wie beispielsweise dem enhanced GFP (eGFP) oder enhanced YFP (eYFP) zu sehen.

Immer größere Bedeutung bekommen auch fluoreszierende Proteine aus Korallen (Anthozoa).^[8] Zu nennen sind hier die zoanFP (aus Zoanthus sp.) oder auch das rot fluoreszierende Protein drFP583 (aus Discosoma), Handelsname DsRed. Viele dieser Proteine wurden bereits mutiert und in ihren Eigenschaften verändert, um andere Eigenschaften zu gewinnen. Viele fluoreszierende Proteine sind Tetramere. Dies wird genutzt, indem man unterschiedlich schnell entwickelnde Monomere einbaut. Dabei verändert sich also die Farbe des Proteins mit der Zeit.^[9] Solche Fluoreszenz-Timer sind nützlich, um beispielsweise das Alter von Organellen feststellen zu können. Die DsRed-Mutante E5 hat beispielsweise diese Eigenschaft.

Das grün fluoreszierende Protein in der Kunst

Die auf der Struktur des grün fluoreszierenden Proteins beruhende Plastik Steel Jellyfish ('Stahlqualle') (2006). Das Bild zeigt die etwa 1,40 m hohe Edelstahlskulptur auf dem Gelände der Friday Harbor Laboratories auf der San Juan Insel im US-Bundesstaat Washington, wo das GFP entdeckt wurde.^[10]

Der deutsch-amerikanische Künstler Julian Voss-Andreae, der sich auf „Protein-Skulpturen“ spezialisiert hat^[11], schuf 2004 eine Plastik, die auf der Struktur von GFP beruht^[12].

Quellen

Literatur

• R.Y. Tsien: The green fluorescent protein. In: Annual Review in Biochemistry. Band 67, 1998, S. 509-544. PMID 9759496 doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.509
• Martin Chalfie und Steven Kain: GFP: Properties, Applications and Protocols. 2. Auflage, Wiley & Sons, Hoboken 2005, ISBN 0-471-73682-1
• M. Zimmer: Glowing Genes. A Revolution in Biotechnology. Prometheus Books, Buffalo, NY 2005, ISBN 1-59102-253-3
• Daniel Veith, Martina Veith: Biologie fluoreszierender Proteine: Ein Regenbogen aus dem Ozean Biologie in unserer Zeit, 6/2005, S. 394-404. doi:10.1002/biuz.200410295
• Michael Groß: Forschung aktuell: Grünes Licht für Biologen. In: Spektrum der Wissenschaft Dez. 2008 S. 14
• Manuel Gunkel, Fabian Erdel, Karsten Rippe, Paul Lemmer, Rainer Kaufmann, Christoph Hörmann, Roman Amberger and Christoph Cremer: Dual color localization microscopy of cellular nanostructures In: Biotechnology Journal, 2009, 4, 927-938. ISSN 1860-6768

Siehe auch

• GFP-cDNA
• Moderne Untersuchungsmethoden in der Zellbiologie: FRET
• Leuchtkaninchen (Anwendung in der Kunst)

Weblinks

Commons: Grün fluoreszierendes Protein – Sammlung von Bildern, Videos und Audiodateien

• Green Fluorescent Protein – History (engl.)
• Protein Database: Molecule of the Month – Green Fluorescent Protein (GFP) (engl.)
• Interpro: Protein of the Month: Green Fluorescent Protein. (engl.)
• Umweltforschungszentrum: Mikrobiologen bringen Bakterien zum Leuchten.
• The Nobel Prize in Chemistry 2008 (engl.)
• Proteopedia: Green Fluorescent Protein (engl.)
• Nature Reviews Poster: Fluorescent Proteins Illuminate Cell Biology (engl.)
• GFP - GFP von A bis Z, mit fantastischen Bildern und neuesten wissenschaftlichen Informationen (engl.)