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CRISPR/Cas-Methode

CRISPR/Cas-Komplex mit DNA

Die CRISPR/Cas-Methode (von engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - gruppierte kurze palindromische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen und CRISPR-associated - CRISPR-assoziiertes Protein) ist eine molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,[1] auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.[2] Aufgrund der einfachen Durchführung, der Skalierbarkeit hinsichtlich unterschiedlicher Zielsequenzen und der geringen Kosten wird die CRISPR/Cas-Methode zunehmend in der Forschung eingesetzt.[3][4]

Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR/Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna veröffentlicht. Die wissenschaftliche Fachzeitschrift Science erklärte die CRISPR-Methode zum Breakthrough of the Year 2015.[5]

Prinzip

Überblick der drei Phasen des CRISPR/Cas9-Prozesses als Abwehrmechanismus[6]

Die CRISPR/Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR.[7][8] Sie wird als Methode verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können beispielsweise durch zwei Schnitte DNA-Sequenzen entfernt – oder es kann im Anschluss an einen Schnitt eine andere DNA-Sequenz an der Schnittstelle eingefügt werden.

Das DNA-schneidende Enzym namens Cas (von englisch CRISPR-associated ‚CRISPR-assoziiert‘) bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Auf diese RNA-Sequenz folgt eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine DNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die RNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden DNA. Durch die Verkettung des Enzyms Cas, der RNA und der DNA wird das DNA-schneidende Enzym Cas in die räumliche Nähe der gebundenen DNA gebracht, woraufhin das Enzym die (indirekt gebundene) DNA schneidet. Im Sonderfall einer Einfügung von DNA in die Schnittstelle wird eine weitere DNA hinzugegeben, die an ihren beiden Enden jeweils überlappende Sequenzen für eines der beiden Enden der Schnittstelle aufweist. Die einzufügende DNA wird durch die zelleigene DNA-Reparatur mit den Enden der Schnittstelle verbunden. Bei einer Variante des Systems (Prime Editing) ist keine einzufügende DNA für eine Einfügung nötig, da die einzufügende Sequenz durch eine RNA-Verlängerung codiert wird.

Eigenschaften

3D-Struktur des CRISPR-Cas9-Komplexes
CRISPR-Cas9 kann als molekulares Werkzeug gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einführen
Die durch CRISPR-Cas9 gezielt eingeführten DNA-Doppelstrangbrüche eröffnen den Weg zu genetischer Manipulation

Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[9] binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. In Bakterien folgt auf die crRNA repeat-Sequenz eine crRNA-spacer-Sequenz, die an die Ziel-DNA bindet. Beide Teile werden zusammen als crRNA bezeichnet. Die crRNA-spacer-Sequenz dient in der Funktion eines variablen Adapters, die komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Die crRNA-repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden,[10] wodurch eine Änderung der Proteinfaltung von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der crRNA-spacer-Sequenz durch Basenpaarung gebunden wird.[11] Bei der CRISPR/Cas-Methode wird die crRNA-spacer-Sequenz geändert, um an eine andere Ziel-DNA zu binden. Die Sequenz des crRNA-spacer bestimmt, welche Ziel-DNA-Sequenz gebunden wird.

Neben Cas9 und der crRNA ist das Vorhandensein eines PAM-Motivs (englisch protospacer adjacent motif ‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘) mit der Sequenz NGG (mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen) in der Ziel-DNA notwendig für eine Aktivierung von Cas9.[12] Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. Zudem ist noch eine weitere RNA notwendig, die tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA. Die tracrRNA ist teilweise komplementär zur crRNA, weshalb sie aneinander binden. Die tracrRNA bindet an eine Vorläufer-crRNA, bildet eine RNA-Doppelhelix und wird durch die RNase III in die aktive Form überführt.[13][1][14] Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden (sgRNA ‚single guide RNA‘).[1] Durch diese Komponenten wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle an beiden Strängen der Ziel-DNA geschnitten. In lebenden Organismen folgt nach einem doppelsträngigen DNA-Schnitt eine DNA-Reparatur. Die Reparatur des erzeugten Doppelstrangbruchs erfolgt durch homology-directed repair (HDR) oder durch non-homologous end joining (NHEJ).

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System und das CRISPR/Cas12b-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN) und Zinkfingernukleasen (ZFN) verwendet werden. Jedoch sind diese beiden Methoden mit höherem Aufwand zur Anpassung an unterschiedliche Zielsequenzen verbunden, da zuerst ein Proteindesign zur Änderung der Bindungsspezifität notwendig ist, während die Bindungsspezifität bei Cas-Proteinen je nach Verwendung durch die gebundene crRNA bzw. sgRNA erfolgt und somit leichter zu ändern ist. Alle diese Methoden werden umgangssprachlich als Genschere bezeichnet.

Unterschiede zwischen Cas9, Cpf1 und Cas12b

Eigenschaft Cas9[15] Cpf1[15] Cas12b[16]
Struktur 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA 1 RNA notwendig (keine tracrRNA) 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA
Überhang keinen (blunt end) sticky end sticky end
Schnittstelle proximal zur Erkennungssequenz distal zur Erkennungssequenz distal zur Erkennungssequenz
Zielsequenz G-reiches PAM T-reiches PAM T-reiches PAM
Zelltyp teilende Zellen ruhende Zellen unbekannt

Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-Oligonukleotids anstatt eines RNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.[17][18] Der Effekt der Unterdrückung eines Gens durch Verwendung von CRISPR/Cas besitzt verschiedene Ähnlichkeiten mit demjenigen der RNA-Interferenz, da bei beiden bakteriellen Abwehrmechanismen kurze RNA-Stücke von etwa 18 bis 20 Nukleotiden die Bindung an das Ziel vermitteln.[19]

Anpassung an die Zielsequenz

Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA-spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese crRNA zu einer tracrRNA hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die an die Ziel-DNA bindende Sequenz besteht aus 20 Nukleotiden, von denen vor allem die 12 an das PAM angrenzenden Nukleotide für die Bindungsspezifität entscheidend sind.[20] Durch das Cas9 mit den entsprechend geänderten RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können. Die gleichzeitige Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet.

Nukleotidsubstitution

Einzelne Cytidine können durch ein Fusionsprotein aus Cas9 ohne doppelsträngige Endonuklease-Aktivität mit einer Cytidin-Deaminase in Thymidin umgewandelt werden.[21] Entsprechend kann mit einem Fusionsprotein, das die Adenosin-Deaminase enthält, ein Adenosin in Guanosin verändert werden.[22] In beiden Fällen entstehen Substitutionsmutationen. Da bei diesen Methode nur einzelne Basen verändert werden, ohne dass die DNA geschnitten wird, wird dieses Verfahren als Base Editing bezeichnet.

Insertionen

Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[23] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[24]

Einbringung in Zellen

Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[25] Bäckerhefe,[26] Taufliegen,[27] Zebrabärblinge,[28] Mäuse[29] und Menschen.[30][31] Üblicherweise werden Gene von Cas mit Kernlokalisierungssignal und sgRNA per Plasmid in einen Organismus eingefügt, alternativ kann auch der Komplex aus Cas9 mit einer sgRNA in Zellen eingeschleust werden.[32]

Für ein Genome Editing in der Keimbahn werden als Methoden zur Einschleusung des CRISPR/Cas9 die Elektroporation und die Mikroinjektion eingesetzt.

Spezifität

Fehlbindungen durch Schleifenbildung in der Ziel-DNA (links) oder der sgRNA (rechts)

Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen an unerwünschten Stellen können unerwünschte Mutationen entstehen, die als off-target-Effekte bezeichnet werden.[33][34][35][36] Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die off-target-Effekte fallen Punktmutationen (Basenänderungen),[37] Deletionen (Entfernungen von DNA-Sequenzen),[38][39] Insertionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen),[36] Inversionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge)[36] und Translokationen (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).[40][39] Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte off-target erfolgten.[33][38] Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,[41][33] die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht reproduzierbare Ergebnisse.[42] Als sicherheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von Krebs angesehen.[43] Die Ursachen für unspezifische Schnitte lassen sich in Basenfehlpaarungen und Schleifenbildungen (der sgRNA oder der Ziel-DNA) einteilen.[38]

Im Jahr 2015 hat ein Team chinesischer Forscher 86 menschlichen Embryonen die korrekte Version des Beta-Globin-Gens injiziert, um den der Beta-Thalassämie zugrunde liegenden Defekt zu korrigieren; dabei wurde festgestellt, dass das korrekte Gen an der richtigen Stelle nur in vier Fällen nachgewiesen werden konnte, in den vier Stellen lag aber ein Mosaik vor.[44]

Erhöhung der Spezifität

Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden Mutagenese werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Spezifität untersucht,[45][46] wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch Kombination mit anderen Endonukleasen.[47] Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.[48][49][40][50][51] Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um off-target-Effekte vorherzusagen.[52][53]

Paired Nickases

Die Mutation von Asparaginsäure zu Alanin an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) oder von Histidin zu Alanin an der Position 840 (H840A) inaktiviert die doppelsträngige Endonukleasefunktion des gebundenen DNA-Stranges unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion und einer einzelsträngigen Endonukleasefunktion.[54][55] Zudem wird die Spezifität durch die Affinität der RNA-DNA-Bindung an Cas9 bestimmt.[56][57][58] Durch Verwendung zweier verschiedener sgRNA, deren an die Ziel-DNA bindende Sequenzen geringfügig versetzt sind, entstehen zwei verschieden bindende Cas-RNA-Komplexe, wodurch die Spezifität des Schnitts erhöht werden kann.[54][59] Dabei werden zwei geringfügig verschiedene Cas9-sgRNA-Komplexe mit unterschiedlicher Spezifität gebildet (paired nickases). Zudem entstehen durch die versetzten Einzelstrangbrüche sticky ends, die eine Insertion einer DNA mit komplementären sticky ends erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch die Basenexzisionsreparatur[54] und die HDR geschlossen,[60] die weniger Mutationen als die Reparatur per NHEJ erzeugen.[54]

Proteindesign von Cas9

Die Mutation D1135E (Änderung von Asparaginsäure zu Glutaminsäure an der Position 1135) von SpCas9 verändert die Bindungsspezifität für das protospacer adjacent motif (PAM) und senkt die Anzahl unspezifischer Schnitte.[61] Auch die HF1-Mutante von Cas9 führt zu einer Minderung unspezifischer DNA-Schnitte.[62]

dCas9-FokI

Die Kombination von Cas9 mit inaktivierter Nukleasefunktion (dCas9) mit der Endonuklease FokI wurde entwickelt, um die Spezifität des DNA-Schnitts zu erhöhen.[47][63][64] FokI wird nur als Homodimer aktiv. Dadurch wird die Anzahl unspezifischer Schnitte auf 1/10.000 gemindert.

BhCas12b v4

Das Protein Cas12b (alter Name C2c1, ein Cas des Typs V, Klasse II) aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.[65] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.[65] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.[65]

dCas9-RT: Prime Editing

Eine deaktivierte Cas9 (dCas9) – die noch über eine RNA an DNA binden kann, aber ohne DNA zu schneiden – wurde als Fusionsprotein mit einer reversen Transkriptase (RT) kombiniert.[66] Reverse Transkriptasen verwenden eine RNA-Vorlage, um DNA herzustellen – sie sind RNA-abhängige DNA-Polymerasen. Zusätzlich wird eine prime editing guide RNA (pegRNA) benötigt, die sowohl die crRNA-repeat-Sequenz für die Bindung von Cas9 und eine an die Ziel-DNA bindende RNA-Sequenz als auch eine RNA-Vorlagensequenz zur Änderung der DNA-Sequenz (analog zu einem Primer) enthält.[66] Dadurch können Insertionen, Deletionen und alle 12 möglichen Punktmutationen durchgeführt werden, ohne dass mutationsanfällige Doppelstrangbrüche entstehen und im Falle einer Insertion ohne Notwendigkeit einer einzufügenden DNA-Sequenz.[66]

Regulation

Die Verwendung von Anti-CRISPR-Proteinen wurde zur konditionalen Hemmung von CRISPR/Cas sowie zur zeitlichen, örtlichen (zelltypspezifischen) oder zellzyklusabschnittsspezifischen Steuerung der CRISPR-Cas-Methode vorgeschlagen.[67] Da CRISPR/Cas DNA schneidet, solange es aktiv ist, kann eine zeitliche Begrenzung auch unspezifische Schnitte begrenzen, die zu unerwünschten Mutationen führen können.[67]

Beispielsweise werden Anti-CRISPR-Proteine zu einem gewünschten Zeitpunkt induziert[68] oder es werden Fusionsproteine von Anti-CRISPR-Proteinen mit lichtgesteuerten Proteinen zur zeitlichen Steuerung der Methode verwendet.[69] Die Kombination lichtsensitiver Proteine mit Anti-CRISPR-Proteinen ermöglicht eine Aktivierung von CRISPR-Cas nur während einer Bestrahlung mit Licht, beispielsweise die Kombination des Anti-CRISPR-Proteins AcrIIA4 (ein Hemmstoff von Cas9) mit dem lichtsensitiven Protein LOV2 aus Avena sativa (Saathafer), die auch CASANOVA genannt wird.[69] Durch die Verwendung zelltypspezifischer Promotoren vor den Genen von Cas und sgRNA kann die örtliche Wirkung gesteuert werden. Außerdem wurde durch die Kombination der Gene von Anti-CRISPR-Proteinen (AcrIIC1, AcrIIC3 und AcrIIC1) mit Bindungsstellen für miRNAs, die nur in bestimmten Geweben (Leberzellen und Herzmuskelzellen) vorkommen und dort die Bildung des Anti-CRISPR-Proteins hemmen, eine gewebespezifische Steuerung für Leber- und Herzmuskelzellen ermöglicht.[70] Durch die Verwendung zellzyklusabschnittsspezifischer Promotoren (Promotoren von Cyclinen) kann eine Wirkung auf einen Abschnitt im Zellzyklus begrenzt werden.

Typen

Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[71] Die Familien können in zwei Klassen mit sechs Typen (Klasse I mit Typen I, III und IV sowie Klasse II mit Typen II, V und VI) und weiter in 19 Subtypen eingeteilt werden.[72][73] Bei Klasse I besteht der Proteinanteil aus mehreren Proteinen in einem Proteinkomplex, während Klasse II nur ein Protein verwendet.[72] Typ I, II und III-A binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ III-B einzelsträngige RNA bindet und schneidet.[73][74] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[74] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[74] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[73] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[73]

Das Cas9 stammt meistens entweder aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9), wobei die kodierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.[75] Cas9 gehört zum Typ II und wird vermehrt eingesetzt, da der Proteinanteil nur aus einem Protein besteht, wodurch die Klonierung und Überexpression weniger aufwändig ist. Cas-Proteine des Typs I sind dagegen Proteinkomplexe aus mehreren kleinen Proteinen.[76]

Klassifizierung

Aufgrund der evolutionären Entwicklung von Pathogenen und der daraus resultierenden Vielfalt an Erregern müssen sich antivirale Abwehrmechanismen den verschiedenen Pathogenen anpassen können. Dieses Phänomen beschreibt man in der englischsprachigen Literatur als evolutionary arms race (deutsch evolutionäres Wettrüsten).[77][78] Aufgrund dessen haben CRISPR/Cas-Systeme als wichtige Akteure der antiviralen Abwehrmechanismen sich ebenfalls den evolutionären Änderungen angepasst. Dies resultierte in einer Erhöhung der Diversität hinsichtlich der Genzusammensetzung des cas-Operons, der Architektur des CRISPR-Genlocus und der Gensequenzen (auch innerhalb der Cas-Core-Gene). Bei den Cas-Core-Genen handelt es sich um die cas-Gene cas1 bis cas6, die innerhalb vieler CRISPR/Cas-Systemvarianten konserviert sind.[79]

Eine einfache und rationale Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen erweist sich aus folgenden Gründen als vorteilhaft:

  • Erklärung der Herkunft und Evolution der Diversität von CRISPR/Cas-Systemen
  • Mitverfolgung und Integration neu entdeckter CRISPR/Cas-Systemvarianten
  • kohärente Annotation von CRISPR/Cas-Genloci in mikrobiellen Genomen

Die seit den Anfängen der CRISPR-Forschung verwendete Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen anhand der Phylogenese des Cas1-Proteins[80] erwies sich nach weiteren Entdeckungen von Genomen mit CRISPR/Cas-Genloci als problematisch, weil die Organisation und Phylogenese der Gene des Effektormoduls von der Phylogenese des Cas1-Proteins abwich. Unter einem Effektormodul versteht man eine Gruppe von cas-Genen, die zur Identifizierung von genetischem Material dient. Des Weiteren existiert ein Adaptationsmodul, welches ebenfalls cas-Gene umfasst und mithilfe von Effektorproteinen zur Protospacer-Auswahl beiträgt, die in das bakterielle Genom integriert werden können.[81][82] Ursache für die phylogenetischen Abweichungen ist wahrscheinlich die Rekombination zwischen den Effektor- und Adaptationsmodulen (englisch module shuffling).[83][84] Somit entschied man, dass charakteristische Merkmale des Effektormoduls zum Klassifizierungsmerkmal von CRISPR/Cas-Systemen wurde.

Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen[85]
Klasse Typ Ziel Operon-Organisation1 Subtyp Bakterienstamm
I
I
DNA
 cas6, SS (cas11), cas7, cas5, cas8a1, cas3’, cas3’’, cas2, cas4, cas1, cas4, CRISPR
I-A
 Archaeoglobus fulgidus, AF1859, AF1870-AF1789
DNA
 cas6, cas8b1, cas7, cas5, cas3, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-B
 Clostridium kluyveri, CKL_2758-CKL_2751
DNA
 cas3, cas5, cas8c, cas7, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-C
 Bacillus halodurans, BH0336-BH03342
DNA
 cas3, cas8u2, cas7, cas5, cas6, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-U
 Geobacter sulfurreducens, GSU0051-GSU0054, GSU0057-GSU0058
DNA
 cas3’, cas3’’, cas10d, cas7 (csc2), cas5 (csc1), cas6, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-D
 Cyanothece sp., Cyan8802_0527-Cyan8802_0520
DNA
 cas3, cas8e (cse1), SS (cas11, cse2), cas7, cas5, cas6, cas1, cas2, CRISPR
I-E
 Escherichia coli K12, ygcB-ygbF
DNA
 cas1, cas2, cas3, cas8f (csy1), cas5f1 (csy2), cas7f1 (csy3), cas6f, CRISPR
I-F
 Yersinia pseudotuberculosis, YPK_1644-YPK_1649
DNA
 cas1, cas2, cas3, cas7f2, cas5f2, cas6f, CRISPR
I-F
(Variante)
 Shewanella putrefaciens CN-32, Sputcn32_1819-Sputcn_32_1823
IV
Plasmide[86]
 dlnG (csf4), cas6-like, cas8-like (csf1), cas7 (csf2), cas5 (csf3), CRISPR
IV-A
 Thioalkalivibrio sp. K90mix, TK90_2699-TK90_2703
Plasmide[86]
 cas8-like (csf1), SS (cas11), cas7 (csf2), cas5 (csf3), CRISPR
IV-B
 Rhodococcus jostii RHA1, RHA1_ro10069-RHA1_ro10072
III
DNA/RNA
 cas6, cas10, SS (cas11), cas7 (csm3), cas5 (csm4), cas7 (csm5), csm6, cas1, cas2, CRISPR
III-A
 Staphylococcus epidermidis, SERP2463-SERP2455
RNA?
 cas10, cas7 (csm3), cas5 (csx10), SS (cas11, csm2), cas7 (csm5), cas7 (csm5), all1473, cas7 (csm5), CRISPR
III-D
 Synechocystis sp. 6803, sll7067-sll7063
DNA/RNA
 cas7 (cmr1), cas7 (cmr6), cas10, cas7 (cmr4), SS (cas11, cmr5), cas5 (csmr3), CRISPR
III-C
 Methanothermobacter thermautotrophicus, MTH328-MTH323
DNA/RNA
 cas7 (cmr1), cas10, cas5 (cmr3), cas7 (cmr4), SS (cas11, cmr5), cas6, cas7 (cmr6), CRISPR
III-B
 Pyrococcus furiosus, PF1131-PF1124
II
II
DNA
 cas9, cas1, cas2, cas4, tracrRNA, CRISPR
II-B
 Legionella pneumophila str. Paris, Ipp0160-Ipp0163
DNA
 cas9, cas1, cas2, csn2, tracrRNA, CRISPR
II-A
 Streptococcus thermophilus, str0657-str0660
DNA
 cas9, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
II-C
 Neisseria lactamica 020-06, NLA_17660-NLA_17680
DNA
 cas9, tracrRNA, CRISPR, cas4, cas2, cas1
II-C
(Variante)
 Micrarchaeum acidiphilum ARMAN-1, BK997_03320-BK997_03335
V
DNA
 cas12a (cpf1), cas4, cas1, cas2, CRISPR
V-A
 Francisella cf. novicida Fx1, FNFX1_1431-FNFX_1428
DNA
 cas12e (casX), cas4, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
V-E
 Deltaproteobacteria bacterium, A2Z89_08250-A2Z89_08265
DNA
 cas12b1 (c2c1), cas4, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
V-B
 Alicyclobacillus acidoterrestris, N007_06525-N007_06535
DNA
 cas4, cas1, cas2, cas12b2, tracrRNA, CRISPR
V-B
(Variante)
 Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, A2167_01675-A2167_01685
DNA
 cas1, cas12c (c2c3), CRISPR
V-C
 Oleiphilus sp., A3715_16885-A3715_16890
DNA
 cas1, CRISPR, cas12d (casY)
V-D
 Bacterium CG09_39_24, BK003_02070-BK003_02075
?
 c2c4, CRISPR
V-U1
 Gordonia otitidis, GOOTI_RS19525
?
 c2c8, CRISPR
V-U2
 Cyanothece sp. PCC 8801, PCC8801_4127
?
 c2c5, CRISPR
V-U5
 Cyanothece sp. PCC 8801, PCC8801_2993-PCC8801_2997
?
 c2c10, CRISPR
V-U3
 Bacillus thuringiensis HD-771, BTG_31928
?
 c2c9, CRISPR
V-U4
 Rothia dentocariosa M567, HMPREF0734_01291
VI
RNA
 cas13a (c2c2), cas1, cas2, CRISPR
VI-A
 Leptotrichia shahii, B031_RS0110445
RNA
 WYL, cas13d, cas1, cas2, CRISPR
VI-D
 Ruminococcus bicirculans, RBI_RS12820
RNA?
 cas13c (c2c7), CRISPR
VI-C
 Fusobacterium perfoetens, T364_RS0105110
RNA?
 cas13b (c2c6), csx28, CRISPR
VI-B1
 Prevotella buccae, HMPREF6485_RS00335-HMPREF6485_RS00340
RNA?
 csx27, cas13b (c2c6), CRISPR
VI-B2
 Bergeyella zoohelcum, HMPREF9699_02005-HMPREF9699_02006
1 Die fett gekennzeichneten Gene stellen Gene von Effektorkomplexen von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse I und Gene von Effektorproteinen von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse II dar.

Anwendungen

Verwendungsbeispiel des CRISPR/Cas-Systems in einem Plasmid
Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (dCas9) im Zuge der CRISPRi

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing (Deletionen/Gen-Knockout[87] und Insertionen) und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[88][89]

Problematisch für humane Anwendungen könnte jedoch sein, dass das Immunsystem die Endonuklease Cas9, die bakteriellen Ursprungs ist, als Antigen erkennt. Über 80 % aller gesunden Menschen zeigen sowohl eine Antikörper-basierte humorale Immunantwort, als auch eine auf T-Gedächtniszellen basierte zelluläre Immunantwort. Ursache hierfür ist, dass die meisten Menschen im Laufe ihres Lebens schon einmal mit Bakterien wie S. pyogenes oder S. aureus in Kontakt kamen und sich so entsprechende Antikörper und Gedächtniszellen bilden konnten.[90] Körperzellen, deren Genom mit CRISPR/Cas9 editiert wurde, können prinzipiell von cytotoxischen T-Zellen erkannt und durch Apoptose vernichtet werden. Der therapeutische Effekt wäre somit nicht mehr gegeben. Diese Problematik wird aktuell (Stand 2018) intensiv diskutiert.[91][92][93]

Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von Krankheitserregern chronischer Infektionskrankheiten wie des Hepatitis-B-Virus[94] und des HIV[95][96] eingesetzt. Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von Onkogenen und somit zur Untersuchung der Tumorentstehung verwendet.[97][98] Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten Genen eingesetzt.[99] Zudem wird es zur Korrektur von Mutationen bei der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen[100] und embryonaler Stammzellen verwendet.[101][102] Weitere Anwendungen werden untersucht.[103]

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, und dies durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease (dCas9) kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, das unter anderem analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt,[104] z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[105] Ebenso kann im Zuge der CRISPRa mittels dCas9 als Fusionsprotein mit einem Aktivator an einer anderen, bestimmbaren Stelle im Genom eine Transkription eingeleitet werden. Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[106] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von Mäusen mit komplexen Genomveränderungen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[29]

Pflanzenzüchtung

Die CRISPR-Methode eröffnet Pflanzenzüchtern die Möglichkeit, Sorten von Nutzpflanzen auf eine leichtere, effizientere und flexiblere Art zu verändern.[107] Für mehrere Nutzpflanzen liegen bereits Studien vor, aber es sind noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt.[108][109][110]

Caribou Biosciences, die 2011 von Doudna und Charpentier gegründete Firma, ging eine strategische Partnerschaft mit DuPont Pioneer ein. Abhängig vom Ausgang des Patentstreits könnte DuPont daher die Rechte an der Anwendung der Methode bei wichtigen Nutzpflanzen wie Mais, Raps und Sojabohne erhalten und Caribou für kleinere Märkte wie Obst und Gemüse. Unklar ist auch, wie sich der letztendliche Patentinhaber hinsichtlich der Lizenzierung der Methode verhalten wird.[108][109] Im September 2016 vergab das Broad-Institut eine (nicht exklusive) Lizenz zur Anwendung der Methode an Monsanto. Von der Lizenz ausgeschlossen sind Gene Drive sowie Anwendungen bei Tabak und die Herstellung steriler Pflanzen.[111]

Gleichzeitig besteht weiterhin Unklarheit bezüglich der Regulierung von CRISPR-Pflanzen (ausschließlich mit Deletionen, ohne Insertionen) in verschiedenen Ländern. Die für die mögliche zukünftige kommerzielle Nutzung von CRISPR-Pflanzen in der Landwirtschaft entscheidende Frage ist, ob diese rechtlich als gentechnisch veränderte Pflanzen angesehen werden, sofern nur etwas aus dem Genom entfernt und kein Transgen eingefügt wurde, da gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere in der EU sehr streng reguliert sind.[108][109][110] Das US-Landwirtschaftsministerium verkündete bereits im April 2016, zwei mit der CRISPR-Methode hergestellte Organismen, einen nicht-bräunenden Champignon und einen Wachsmais mit verändertem Stärkegehalt, nicht zu regulieren.[112]

Bekämpfung von Insekten

Entdeckungsgeschichte

Siehe auch: CRISPR#Entdeckung und Eigenschaften

Die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea erfolgte in mehreren Schritten seit es im Jahr 1987 zum ersten Mal beschrieben wurde.[44] Obwohl die Funktion von CRISPR/Cas noch nicht bekannt war, wurde es zu Beginn der 1990er Jahre für das sog. Spoligotyping (die Genom-Typisierung von Bakterien-Isolaten über die Erkennung der unterschiedlichen Spacer innerhalb der direct-repeat-region) genutzt.[44]

Vor allem in den frühen 2000ern wurden die Zusammenhänge zwischen den CRISPR-Sequenzen der DNA und den cas-Genen sowie ihre Bedeutung in der Immunabwehr der Bakterien identifiziert. Ab 2008 war bekannt, dass das adaptive CRISPR DNA bindet.[113]

Im Jahr 2011 zeigte eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dass mittels des CRISPR/Cas-Systems der Mikroorganismen spezifische DNA-Ziele in vitro geschnitten werden können.[44][114] Sie reichten ihre wissenschaftliche Arbeit am 8. Juni 2012 bei der Fachzeitschrift Science ein, wo sie am 28. Juni veröffentlicht wurde.[1] Parallel zu ihnen arbeitete eine Arbeitsgruppe um Virginijus Šikšnys an der Methode, die bereits im April 2012 ihre Arbeit bei Cell einreichten; diese wurde jedoch abgelehnt, wenngleich die Herausgeber von Cell dem Artikel nachträglich eine große Bedeutung zuschrieben. Im Mai reichten Šikšnys und Kollegen das Papier in den Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) ein, wo es am 4. September online veröffentlicht wurde.[115]

Doudna und Charpentier beschrieben, wie sich in einem Bakterium gezielt Abschnitte aus dem Erbgut entfernen lassen. Dem Neurowissenschaftler Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology gelang es später, die CRISPR-Methode nicht nur im Bakterium anzuwenden, sondern für alle Zellen zu optimieren.[116] Der Leiter des Broad Institute und Vorgesetzte von Feng Zhang, Eric Lander, verfasste im Januar 2016 einen Artikel über die Anteile der verschiedenen Wissenschaftler an der Entdeckung des CRISPR/Cas-Systems,[117] der aufgrund von einseitiger Darstellung und eines vermuteten Interessenskonflikts kritisiert wurde.[118][119][120]

Charpentier und Doudna erhielten 2014 für die Entdeckung der CRISPR/Cas-Methode den mit drei Millionen Dollar für jeden Preisträger dotierten Breakthrough Prize in Life Sciences[121] des Jahres 2015 und wurden mit zahlreichen weiteren Preisen bedacht. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach Veröffentlichung ist die Methode eine Standardmethode in Laboren geworden und es wurden darüber in diesen fünf Jahren 2.500 wissenschaftliche Veröffentlichungen publiziert.[122]

Patentstreit

Sowohl Doudna und Charpentier (University of California, Berkeley) als auch Zhang (Broad) beantragten grundlegende Patente auf die CRISPR/Cas-Methode. Doudna und Charpentier reichten ihren Antrag beim United States Patent and Trademark Office (USPTO) im Mai 2012, Zhang im Dezember 2012 ein, und Zhang beantragte ein Schnellverfahren. Zhang wurden im Mai 2014 Patentrechte zugesprochen. Das USPTO begründete diese Entscheidung damit, dass Zhang die Methode für alle Zellen tauglich machte.[116] Doudna und Charpentier reichten Klage beim USPTO gegen diese Entscheidung ein. Das Verfahren zur Klärung der Urheberschaft lief im Januar 2016 an. Broad argumentiert, Berkeley habe die Methode zwar für Prokaryoten (Bakterien), aber nicht hinreichend für Eukaryoten (z. B. Mäusen und menschlichen Zellen) beschrieben. Berkeley argumentiert, der Schritt von Pro- zu Eukaryoten bedürfe keiner erfinderischen Tätigkeit.[123] Im Februar 2017 entschied das USPTO zugunsten von Broad und lehnte die Klage der University of California mit der Begründung ab, dass die Anwendung der von Doudna und Charpentier beschriebenen CRISPR/Cas-Methode auf Eukaryoten nicht offensichtlich sei.[124]

Auch das Europäische Patentamt (EPA) muss im Patentstreit Entscheidungen fällen. Hinsichtlich des Berkeley-Patentantrags hat das EPA bereits argumentiert, der Antrag habe die Erfindung nicht ausreichend beschrieben, da die Hervorhebung der Rolle der PAM-Sequenzen fehle. Berkeley vertritt die Ansicht, dass diese Rolle für Fachleute offensichtlich ist. Dem Broad-Institut wurden hingegen bereits mehrere Patente an der CRISPR/Cas-Methode zugesprochen, die jedoch von mehreren Seiten angefochten wurden. Kläger verweisen zum Beispiel darauf, dass Broads ursprünglicher Patentantrag einen Wissenschaftler der Rockefeller University als an der Erfindung Mitbeteiligten erwähnte, eine spätere Version des Antrags jedoch nicht.[123]

Risiken

Die Methode ist eine verhältnismäßig einfache, preiswerte, leicht verfügbare, punktgenaue und effiziente Technik. In den ersten Jahren war nicht geregelt, ob reine Deletionen, die auch durch zufällige Mutagenese im Rahmen einer Züchtung entstehen können (jedoch bei der Züchtung nicht zielgerichtet), als Gentechnik zu bewerten sind. Kritiker weisen darauf hin, dass es beispielsweise internationaler Standards und Vorsorgemaßnahmen bedürfe, um Wildwuchs und Missbrauch vorzubeugen. Hier bestehen auch Befürchtungen vor kriminellen oder terroristischen Anwendungen; das amerikanische FBI beispielsweise beobachtet entsprechende mehr oder weniger private Do-it-Yourself (DIY)-„Garagen-Bastler“ („Bio-Hacker“). In Bezug auf den Eingriff in die menschliche Keimbahn durch Verwendung einer CRISPR/Cas-Methode auf menschlichen Keimzellen in Verbindung mit einer In-vitro-Fertilisation im Rahmen einer Gentherapie gibt es bioethische Bedenken.[125]

Recht

Der Europäische Gerichtshof (EuGH) entschied am 25. Juli 2018, dass grundsätzlich auch mit der CRISPR/Cas-Methode (Mutagenese) bearbeitete Pflanzen ohne Fremd-DNA als gentechnisch veränderte Organismen (GVO) anzusehen sind und grundsätzlich den in der GVO-Richtlinie vorgesehenen Verpflichtungen unterliegen (Az. C-528/16). Geklagt hatte die französische Bauerngewerkschaft Confédération paysanne und weitere acht Verbände gegen die französische Regierung.[126]

Das Urteil wurde von Umweltschützern gelobt, während Naturwissenschaftler die Auswirkungen kritisch beurteilten, da die Entfernung von DNA auch durch klassische Methoden der Züchtung erreicht würde, wie eine Behandlung mit radioaktiver Strahlung oder mit erbgutverändernden Chemikalien (deren Erzeugnisse nicht als GVO klassifiziert werden), allerdings erfolgen klassische Methoden nach dem Zufallsprinzip.[127] Es sei fraglich, ob von nun an noch Forschungsförderung für entsprechende Projekte gewährt werde. Zudem ist die Zulassung aufwändiger.[127] Auch sei die diesbezügliche Forschung innerhalb der EU für Unternehmen unter den neuen rechtlichen Rahmenbedingungen nicht mehr profitabel. Deshalb werde sie nicht mehr innerhalb der EU erfolgen.[128] Weiterhin wurden nachteilige Auswirkungen auf den Welthandel befürchtet.[129]

Literatur

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Weblinks

Einzelnachweise

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News mit dem Thema CRISPR/Cas-Methode

14.08.2019
Zytologie | Genetik
Crispr-Methode revolutioniert
Forschende der ETH Zürich entwickelten die bekannte Crispr/Cas-Methode weiter. Es ist nun erstmals möglich, Dutzende, wenn nicht Hunderte von Genen in einer Zelle gleichzeitig zu verändern.